博士学位论文

CRISPR 介导的基因激活系统的开

发及应用

Development and application of CRISPR-based gene activation

systems

摘要

基因编辑系统通常依赖于诱导 DNA 双链断裂（ DSBs ） , 然而由 DSBs 引起 的

脱靶位点的突变可能会产生有害的影响，从而限制其在临床治疗中的应用。最 近

CRISPR/Cas9 系统被重新编辑并应用于基因的激活，它可以在天然染色体环 境内对

特定靶点进行基因激活而不产生 DSBs, 是一种很有潜力的治疗策略。目 前，基于卬

Cas9 已经开发多种基因激活系统，但是由于其原间隔子相邻基序 （ PAM ）的限制、

较高的脱靶效应、大体积、免疫原性等，使其在体内外的应用 存在一些局限性。

因此，我们仍需要构建不同类型的 CRISPR 激活系统，为在体 内体外实现高效的基

因激活提供新的可选择的方式。

"Cpfl 是一种 2 类 V 型 CRISPR 系统,不同于 SpCas9 识别 5'-NGG 的 PAM 序列，

它可以识别 5'-TTTV （ V 代表 A, C 或 G ）的 PAM 序列，并具有高特异 性。我们将

"Cpfl 的核酸酶结构域的关键氨基酸进行突变，并结合组蛋白乙酰 转移酶 p300, 构建

d£Z ） Cpfl-p300 激活系统。在 gRNA 的引导下，融合蛋白 dZZ>Cpfl-p300 会与靶位

点结合，并通过促进启动子和增强子区域组蛋白的乙酰 化，使染色质发生重构，

从而增强基因表达。同时，我们也将 dLBCpfl 突变体与 SunTag 系统结合，利用

SunTag 系统的中重复多肽 GCN4 和相应单链可变区抗 体（ scFv ）特异性的结合，

将融合蛋白 ScFv-VP64 招募到靶位点，使转录激活因 子 VP64 在启动子区域富集，

从而增强转录。通过这两种方式，我们基于 LbCpfl 构建了高特异性的转录激活系

统，成功在多种细胞中诱导靶基因高效的表达，拓 展了 CRISPR 激活系统的应用

范围。

QCas9 是目前发现的最小 Cas9 同源体，与卬 Cas9 相比,它具有不同的 PAM 摘

要识别序列，以及较小体积（ 984 个氨基酸，而卬 Cas9 为 1,368 个氨基酸）。因此 我

们将 QCas9 与强效转录激活因子 VPR 结合，构建一系列转录激活系统。其 中，

dQCas9-SunTag-VPR 系统可以强效的激活基因的表达； C/Cas9-VPR 系统可 以正交

性诱导基因的编辑和激活；而基于 VPR-dQCas9 系统进一步缩减和优化 后形成的小

型高效的激活体系（命名为 miniCAFE ） , 在基因插入细胞系中，单个 拷贝 miniCAFE

即可在单条 gRNA 的引导下有效的激活靶基因的表达。同时，由 于其小体积的优

势，我们可以将 miniCAFE 和 gRNA 包装在一个 AAV 载体中进 行体内传递，并成

功激活肝脏中 Fgf21 的表达，调节成年小鼠的能量代谢。因此， miniCAFE 为体内

诱导基因的表达提供了一种新的方法。

综合而言，我们基于 ZiCpfl 和苛 Cas9 构建了多种转录激活系统，并由于 PAM

的不同、 EBCpfl 的高特异性、 0Cas9 的小体积以及免疫原性，这些系统各 有优势，

为基因激活系统在体内外的应用提供了有力的补充，对人类疾病的治疗 具有巨大

的潜力。

关键词 基因激活 CRISPR ZiCpfl SunTag QCas9

博士学位论文

Development and application of CRISPR-

based gene activation systems

ABSTRACT

Genomic editing systems generally rely on the induction of DNA double-strand

breaks (DSBs). However, off-target mutations caused by DSBs may have harmful effects,

which limits their applications in clinical therapy. CRISPR/Cas9 system has recently been

modified and applied to gene activation, which induces gene expression of target sites in<, /p> <